MOLEKULÁRNÍ PATOLOGIE OSTEOARTRÓZY

07. Prosinec 2015

Prof. MUDr. Milan Adam, DrSc.

Hlavní složkou pojivové tkáně je kolagen

Hlavní složkou pojivové tkáně chrupavky je kolagen(asi 70 % sušiny), a to typu II a v menší míře jsou v chrupavce přítomny typy IX a XI. Kolagen typu II je tvořen třemi stejnými řetězci (vzorec molekuly- a1(II)3), tvořenými cca 1000 aminokyselinami každý. Kolagen typu II je charakterizován poměrně velkým množstvím hydroxylysinu (cca 20 na řetězec), který je z velké části glykosylován - postranní cukerné řetězce jsou tvořeny galaktosou event. disacharidem galaktosa - glukosa. Zřejmě tato struktura způsobuje větší solvátý obal kolagenu typu II ve srovnání s typy I či III. C-propeptidy podobně jako u typu I či III jsou mezi sebou spojeny bisulfidickými můstky a po odštěpení od těla molekuly vytvářejí bílkovinu zvanou chondrokalcin o molekulové hmotnosti asi 100000. Kolagen typu XI je tvořen dvěma odlišnými druhy řetězců ( vzorec molekuly - a1(XI)2 a2(XI)), jejichž aminokyselinové složení je podobné typu V. Představuje asi 3% chrupavkového kolagenu a se stárnutím v chrupavce jej ubývá i na úkor kolagenu typu V. Ovšem řetězce obou typů kolagenu vytvářejí hybridní molekuly, obsahující řetězce typu II i typu V. Hyalinní chrupavka dále je tvořena kolagenem typu IX, který se podstatně liší od předchozích dvou typů (Obr.1). Je tvořen třemi různými řetězci a jeho šroubovicová struktura je přerušena třemi nehelikálními oblastmi, přičemž v jednom je molekula jakoby zlomena a v tom místě se váže postranní glykosaminoglykanový řetězec a nadto v tomto místě dochází k vazbě na N-konec typu II nebo na C-konec jiné molekuly typu IX. Na kolagenních fibrilách v hyalinní chrupavce se účestní všechny tři uvedené kolagenní typy, jež jsou navzájem seřetězeny příčnými vazbami typu pyridinolinu, takže chrupavkový kolagen je v extracelulárním prostoru vysoce stabilisován. Proto je pro jeho extrakci třeba použít enzymové štěpení. 

Uvedený typ příčné vazby se vyskytuje ve vyšší koncentraci ještě v kostním kolagenu (typ I). Zatímco příčná vazba stabilizující kolagenní struktury v jiných je odvozena od dvou lys resp. hyl ( lysinoleucin), jsou deoxypyridinolin resp. pyridinolin ( obr.3) odvozeny od tří lys resp. hyl. Stanovení jejich exkrece močí se používá ke sledování intensity odbourávání kostěné tkáně. K jejich stanovení je možné použít metody HPLC nebo ELISA. Podle našich zkušeností dochází ke zvýšení jejich hodnot v moči, když OA proces začne destruovat subchondrální kost. Pokud je proces omezen jen na chrupavku, pohybují se jeho hodnoty v normálních mezích.

Kolageny typů I a III, které jsou podstatně méně glykosylovány nežli typ II, a které mají menší solvátový obal, se ve většině tkání vyskytují společně. V hyalinní chrupavce se vyskytují za patologických podmínek, tzn. když hyalinní chrupavka se mění v chrupavku vazivovou (Adam a Deyl, 1983). V kostech není za fyziologických podmínek kolagen typu I provázen kolagenem typu III jako v jiných tkáních, nýbrž typem V, jehož se stárnutím ubývá ve prospěch typu XI - pro tento fenomen není zatím výklad. Jestliže kolagen tvoří asi třetinu všech bílkovin v organismu, pak kostní kolagen představuje polovinu veškerého kolagenu. Z toho vyplývá, že jeho metabolické pochody ovlivňujípodstatnou měrou ukazatele metabolické kolagenních struktur.

Význam proteoglykanů v mezibuněčné hmotě chrupavky

Jestliže kolagen představuje nejvýznamnější složku hyalinní chrupavky z mechanického hlediska, potom proteoglykany (Obr.4), obsažené rovněž v mezibuněčné hmotě, jsou významné z hlediska transportního včetně uchování fenotypu chondrocytů a také pro svou vysokou hydratační schopnost. Na řetězec hyaluronové kyseliny jsou vázány agrekany ( dříve nazývané proteoglykanové podjednotky) tvořené bílkovinným řetězcem, na nějž jsou vázány postranní řetězce ve formě oligosacharidů, keratansulfanu a chondroitinsulfatu. Vazba agrekanu na hyaluronovou kyselinu je stabilisována dvěma molekulami vazebného proteinu.

Zvýšená aktivita hydrolytických enzymů v kloubu doprovázející hlavně synovitidu (aktivovaná OA), vede ke zvýšenému odbourávání hyaluronové kyseliny i agrekanů, což v samotné chrupavce vede k narušení její vazebné kapacity pro vodu.

Další bílkoviny obsažené v chrupavce

Pro expresi genů resp. uchování fenotypu buněk mají významnou roli adhesivní bílkoviny(CAMs - cell adhesion molecules), které se účastní na interakcích mezi buňkami(ICAM - 1 - intercellular adhesion molecule) nebo mezi buňkami a složkami mezibuněčné hmoty. Tyto interakce jsou významné jak pro proliferaci, tak pro diferenciaci i migraci buněk. Již řadu let známe fibronektin a laminin, interagující s fibroblasty resp. endoleliálními buňkami. Obě tyto molekuly mají zajímavé terciární struktury - molekula fibronektinu, který je glykoproteinem o molekulové hmotnosti asi 200.000, je tvořena dvěma podjednotkamispojenými disulfidickou vazbou (Obr.5), laminin je rovněž glykoproteinem, tvořeným jedním velkým a třemi kratšími řetězci vytvářejícícmi molekulu podoby kříže o molekulové hmotnosti asi 800.000 (Obr.6). V Basálnbích membránách interaguje s kolagenem typu IV, nidogenem, heparansulfátem. Obě tyto bílkoviny mají řadu funkcí - stimulují proliferaci a migraci buněk, jakož i diferenciaci různých buněk ( von der Mark a spol.,1992). Vliv těchto adhesivních bílkovin na buněčný fenotyp ukazuje např. přidání fibronektinu do kultury chondrocytů. Následně dojede ke změně jejichfenotypu a ke změně syntézy kolagenu typu II a syntézu kolagenu typů I a III- chondrocyty se pak dediferencují ve fibroblasty (Pennypacker a spol., 1979).

Významnou skupinu adhesivních bílkovin tvoří cadheriny (calcium dependent cell adhesion molecules), jež se dělí na podskupiny E,N,P a které, jak vysvítá z názvu, ovlivňují buněčné adhese jen v přítomnosti vápníku. Jsou tvořeny poměrně velkým bílkovinným řetězcem ( cca 700 aminokyselin). Nezdá se však, že hrají významnější roli ve chrupavce. Poměrně nedávno byly popsányselctiny, označované též Lec-CAMs. Jejich jedna doména vázající karbohydráty je homologní buď s doménou přítomnou v lektinech (L), nebo epidermálním růstovém faktoru (E) či v bílkovinách vázajících komplement (P). Mezi CAMPs patří i imunoglobuliny, jež jsou lokalizoványvýhradně na povrchu buňky a jako receptory i jako adhesivní molekuly. Jsou označovány jako ICAM - 1, ICAM-2, VCAM-1 a PECAM-1 a jsou přítomny sice hlavně na povrchu krevních buněk (ICAM - 1 je totožný s HLADR), ale lze jej nalézt i na jiných buňkách. Tyto molekuly se zúčastní regulace imunitního systému tím, že zprostředkovávají mezibuněčné interakce (Benton a spol.,1993).

V mezibuněčné hmotě hrají významnou roli i další bílkoviny, které se účastní vazby na chondrocyty event. osteoblasty. Jednou z nich je osteopontin, jenž se váže na buněčné receptory sekvnecí Arg-Gly-Asp-Ser. Jedná se o fosforylovanou bílkovinu, jejíž syntéza je inhibována kalcitoninem. Další takovou bílkovinou je osteonektin, jinak též zvaný SPARC (secreted protein acidic rich in cystein). Je to fosforylovaný glykoprotein, který se váže na plasminogen a tím inhibuje jeho vazbu na kolagen. Tímto způsobem se osteonektin zřejmě účastní ne řízení proteolýzy mezibuněčné hmoty. Zatímco C-koncová doména obsahuje sekvenci s vysokou afinitou k Ca++, N-koncová doména se váže na kolagen typu I. Osteokalcin přítomný jak ve tkáních, tak v séru je označován též jako GLA-protein nebo BGP(bone GLA-protein), protože ve své molekule obsahuje tři zbytky g-karboxyglutamové (GLA) (Obr.7). Kyselina glutamová je karboxylována posttranslačně na posicích 17,21,24 v závislosti na vitamínu K.Ve tkáních i séru se zmnožuje při kalcifikačních procesech a to nejen kostí, nýbrž i jiných tkání ( Deyl a Adam, 1979). Zmnožení osteokalcinu v séru je obvykle doprovázeno zvýšením hladiny sérové kostní alkalické fosfatázy, což je sialoglykoprotein o hmotnosti 120.000 až 200.000. Její hladiny v séru je možno považovat za ukazatele aktivity osteoblastů. Uvedené bílkoviny je možno v séru určovat metodami ELISA a tak při OA určovat intenzitu poškození resp. syntetickou aktivitu subchondrální kosti.

Látky významné pro řízení biologické aktivity buněk chrupavky

V řízení biologických aktivit buněk hrají významnou roli integriny, jež jsou membránovými receptory, tvořenými velkými glykoproteiny o dvou podjednotkách - a a b. Jedná se tedy o heterodimery, jež jsou mezi sebou nekovalentně vázány. b-podjednotka existující asi ve 20 různých variantách, se kombinuje s různými a-podjednotkami, čímž je dána různorodá receptorová aktivita. Zdá se být funkčně významější a její klička je stabilizována bisulfidickými můstky. Velikost jednotlivých podjednotek se pohybuje od 120.000 do 200.000 podle toho, o jakou podjednotku se jedná. V extracelulární části obsahuje b-podjednotka čtyři opakující se domény o 40 aminokyselinách, z nichž poměrně velká část je cystein. Některé a-podjednotky jsou tvořeny těžkými a lehkými řetězci, spojenými navzájem disulfidickými vazbami.

Větší část molekuly integrinů- N-konec je přítomna extracelulárně, kde vytváří kličku, obsahující polární aminokyseliny. Ty pak interagují prostřednictvím iontových vazeb s adhesivními proteiny za konformační změny obou subkomponent včetně cytoskeletální domény. Integrované řetězce procházejí buněčnou membránou a tak zprostředkovávají oboustranný "dialog" mezi intra- a extracelulárním prostředím, ovšemjedná se hlavně o zprostředkování informací z extracelulárního prostředí do buněčného cytoskeletonu, tvořeného soustavou mikrotubulů, mikrolilament a mikrotrabekul, a zodpovědného za nitrobuněčný transport včetně informací. S cytoskeletonem integriny provděpodobně v přímém styku vůbec nejsou, jejich spojení je zprostředkováno dalšími bílkovinami, např. vinkulinem a talinem.

Látky, jež ovlivňují buněčnou proliferaci a diferenciaci, mají vliv i na expresi integrinů, jež většinou interagují se sekvencí RGD(arg-gly-asp) extracelulárních bílkovin. Jsou známy ještě další sekvence, na něž se integriny vážou např.DGEA(asp-gly-glu-ala) nebo LDV(leu-asp-val), u lamininu je vazebným peptidemYIGSR)tyr-ile-gly-ser-arg), u elastinu je vazebným peptidem VGVAPG(val-gly-val-ala-pro-gly). Integrin po vazbě na příslušný ligand změní svou konformaci a tím dojde i ke změně elektrického pole. Tato změna je pak onou informací, které se buňce dostává a jež ovlivňuje nitrobuněčné pochody. Je-li buňka buňka přehlcena informacemi z vnějšku, dojde ke změně v expresi integrinů tak, aby byl snížen počet signálů přicházejících do buňky, tj. jsou syntetizovány takové integriny, které interagují s menším počtem adhesivních proteinů přítomných extracelulárně a tak dojde ke snížení informačního šumu. Kromě toho dojde ke zvýšené syntéze proteinás. Na regulaci jejich tvorby se účastní integriny(Werb a spol.,1989).

Z hlediska chondrocytů, jež jsou ve srovnání s jinými druhy buněk chudé na receptory a netvoří některé integriny např. b1 a b5 (Salter a spol., 1992), je důležitý integrin a1b1, který se ještě dále dělí na VLA-1 až 7 (very late activation antigene). Např.VLA-1 je receptorem pro kolagen a laminin, VLA-2 je receptorem pro kolagen, VLA-3 pro fibronektin, laminin a kolagen, VLA-4 pro fibronektin a cévní CAM(VCAM-1). Chondrocyty normální dospělé hyalinní chrupavky tvoří ve větších množstvích dále integriny a5b1, avb1 a a3, jež exprimují jen někdy a v malých množstvích. Integrin avb3, jež je rovněž obsažen v chondrocytech, svědčí pro přítomnost vitronektinu i v chrupavce. Chondrocyty dále exprimují integriny umožňující jejich vazbu s osteokalcinem, osteopontinem a pochopitelně i s kolageny typu II a VI(Loeser,1993). Vazba integrinů na komponenty extracelulární hmoty je v některých případech závislá na přítomnosti dvoumocných prvků (Mg,Ca), např. vazba kolagenu typů I a II je závislá na Mg++. Adhese fibronektinu je stimulována jak Mg++ tak Ca++. Během stárnutí i za patologických stavů dochází ke změně v expresi integrinů, jak bude dále uvedeno.

Buněčné funkce jsou koordinovány mediátory, jež mají charakter polypeptidů a jsou souhrně nazývány cytokiny. Ty představují heterogenní skupinu molekul, majících různé funkce převážně v oblasti imunitních pochodů. Podle místa původu se označují jako lymfokiny, monokiny a PDGF(plateled derived growth factor). Podle účinku se označují jako interleukiny, jejichž je celá řada, dále sem patří růstové faktory, interkiny-chemokiny, TNF a (katechtin) a b, angiogenetické faktory, hematopoetické faktory a interferony ( INF a,b a g). Specifický účinek na expresi genů pro tvorbu a degradaci extracelulárních komponent mají především IL-1, IL-6,TNF-a(-b). Cytokiny působí většinou na úrovni mRNA, stimulují sekreci proteinas a některé inhibují expresi receptorů(integrinů) pro komponenty mezibuněčné hmoty.

Z hlediska chondrocytů má význačný vliv interleukin-1. který působí stimulačně na expresi integrinu a1, kromě toho způsobuje inhibici buněčné proliferace a tvorby proteoglykanů, i když podporuje jejich uvolňování do extracelulární matrix. Velmi významná je i jeho stimulace tvorby metaloproteináz. Z tohoto hlediska má podobný účinek i TNF. Oba tyto cytokiny v lidské chrupavce podporují tvorbu interleukinu-6, jenž má rovněž vztah k metabolismu chrupavky a je podobně jako interleukin-8 syntetizován mj. fibroblasty. Tyto cytokiny ovlivňují expresi některých integrinů, jež umožňují vazbu složek mezibuněčné hmoty buňkami. Kombinace TNF-a s interferonem-g snižuje tvorbu podjednotky b1. To pochopitelně ovlivňuje interakce mezi buňkami i buněk se složkami mezibuněčné hmoty a tím i syntetické aktivity buněk(Holtmann a Resch,1995). Na druhé straně produkce některých cytokinů je stimulována různými typy kolagenu, tak kolagen typu II indukuje expresi IL-1b , IL-6 a TNF-a. Obdobný účinek, i když méně vyjádřený má i kolagen typu I (Jeng a spol., 1995). Zprávy o úloze IL-1 v rozvoji OA procesu jsou však dosud kontraversní.

Změny v chrupavce při osteoartróze

Při OA dochází v chrupavce i subchondrální kosti k řadě změn. Mění se v chondrocytech exprese genů kodujících kolagen a místo kolagenu II jsou syntetisovány kolageny I a III ( Adam a Deyl,1983). Tuto změnu jsme však zjistili i v mikroskopicky normální chrupavce ve třetím deceniu, takže se zdá, že uvedená změna v expresi genů kodujících různé kolagenní typy souvisí se stárnutím a v OA je jen vystupňována. S tím zřejmě souvisejí i změny v expresi integrinů-místo obvyklých a3b1 a a5b1 se objevují a1b1
a a2b1, jež jsou schopny vázat nově se objevivší kolageny typu I a III a fibronektin, který jsme nebyli schopni prokázat v mladé chrupavce. Vzhledem k tomu, že zmíněné kolageny mají menší solvátový obal nežli typ II, nejsou zřejmě vhodné pro střihová zatížení. Navíc jsou méně odolné vůči nespecifickým proteinásám nežli typ II. Hyalinní chrupavka se tak pomalu mění v chrupavku vláknitou. Při odbourávání chrupavky i kolagenu přecházejí do synoviální tekutiny kolagenní fragmenty, jejichž množství lze stanovit pomocí koncentrace hydroxyprolinu, pyridinolinu či deoxypyridinolinu. Následně pak přecházejí do krve a pak do moče. Avšak podle našich zkušeností, pokud OA proces postihuje jen chrupavku, jsou hodnoty výše uvedených příčněvazebných elementů v moči v normálních mezích. Ke zvýšení jejich koncentrace v moči dochází, když patologický proces postihne subchondrální kost, v níž se tvoří granulační tkáň, degradující svými proteolytickými enzymy kostní trámce s vyplavováním uvedených příčněvazebných elementů do krve a moče. Jinak tedy možno říci, že zvýšené hodnoty pyridinolinů u nemocných OA ukazují na postižení subchondrální kosti destrukčním procesem.

Vlivem proteinas, které se tvoří částečně v chondrocytech a částečně se do chrupavky dostávají ze synoviální tekutiny, dochází ke štěpení proteoglykanu a to jak glykosaminových tak bílkovinných řetězců. Degradační produkty pak je možno detegovat jak v synoviální tekutině, tak v séru, kde koncentrace příslušných fragmentů jsou však příliš nízké. 

Kromě uvedených změn v syntéze chrupavkového kolagenu dochází u některých pacientů k tvorbě protikolagenních protilátek, jejichž sérové hodnoty dosahují někdy i značných titrů, jež tvoří např. pacienti s progresivní polyartritidou, resp. revmatoidní artritidou. Tato skutečnost dobře ilustruje heterogenitu etiopatogenesy OA.

Pro pochopení celého patologického mechanismu při osteoartróze je nutno si uvědomit, že chondrocyty poměrně brzy ztrácejí schopnost normální tvorby kolagenu typu II, a proto veškeré pokusy organismu o reparaci patologického procesu vedou k tvorbě nejvýše fibrilární chrupavky obsahující navíc kolageny typu I a III. Osteofyty sice vytvářejí větší plochu pro roznesení tlaků působících na kloub, ale zvláště u kyčelního kloubů vedou mnohdy k omezení rozsahu pohybu.

Z toho, co bylo řečeno, vyplývá, že u osteoartrózy může být dlouhodobé podávání antirevmatik, jež mají vesměs silný inhibiční vliv na proteosyntézu, škodlivé, protože jejich vlivem dochází i k inhibici syntézy kolagenu v chondrocytech. Na druhé straně není dosud známo, jak zvrátit patologickou syntézu kolagenů typů I a III v chondrocytech při osteoartróze.

V roce 2003 publikují St. Oesser a J. Seifert v Cell Tissue Res.:“ Stimulation of type II collagen biosynthesis and secretion in bovine chondrocytes cultured with degraded collagen“ své závěry potvrzující chondrogenní aktivitu kolagenních peptidů (2000 – 4000 Daltonů), které svým, působením stimulují:

1) proliferaci chondrocytů 
2) stimulují v chondrocytech syntézu kolagenu typu II o 100 % po 11 dnech působení,

čímž potlačují patologickou syntézu kolagenu typu I a III v chondrocytech a přispívají tak k regeneraci kolagenní struktury chrupavky fyziologicky obsahující převážně kolagen typu II, který je oproti patologicky se vyskytujícímu kolagenům typu I a III podstatně více glykozylován glykosaminoglykany (glukosaminsulfát resp. chondroitinsulfát), což zvyšuje jeho schopnost hydratace. To se projeví snížením bolestivosti kloubů v klidu i při pohybu !